Le comité des Etats-Unis d’Amérique (EUA) pour un budget fédéral responsable (CRFB) a rédigé un rapport prévoyant que la dette publique des EUA dépassera le PIB du pays en 2020. Selon le CRFB, le récent projet de loi de secours de 2 000 milliards de dollars, adopté par le Congrès et signé par Trump, a conduit le déficit budgétaire états-unien à monter en flèche à 3 8 00 milliards de dollars, soit 18,7% du PIB total projeté du pays en 2020. Le chien de garde prévoit que le déficit budgétaire tombera à 2 100 milliards de dollars, soit 9,7% du PIB, d’ici la fin de l’année prochaine.
Le CRFB a noté dans son rapport, cependant, que les projections sont basées sur un scénario selon lequel plus aucune facture d’allègement ne sera adoptée et aucun changement au système fiscal n’est effectué, ainsi que l’hypothèse que l’économie des Etats-Unis d’Amérique se remettra rapidement de la pandémie.
« Ces projections sous-estiment certainement les déficits, car elles supposent qu’aucune autre législation n’est adoptée pour faire face à la crise et que les décideurs politiques respectent la loi actuelle en ce qui concerne les autres politiques fiscales et de dépenses. Les projections supposent également que l’économie connaît une forte reprise en 2021 », a suggéré le chien de garde.
Si l’une ou l’autre des conditions n’est pas remplie, la dette publique pourrait continuer à augmenter, atteignant environ 117% de l’économie du pays d’ici la fin de 2025. Cependant, le CRFB suppose que l’économie des Etats-Unis d’Amérique se sera complètement rétablie et sera revenue « à son trajectoire pré-crise » à ce moment-là.
Le chien de garde a souligné dans son rapport que les emprunts contractés par l’administration Trump et qui devraient faire monter en flèche la dette publique des Etats-Unis d’Amérique étaient « à la fois inévitables et nécessaires à la lumière de la pandémie actuelle ». La présidente du CRFB, Maya MacGuineas, a noté que ces fonds sont nécessaires non seulement pour sauver des vies, mais aussi pour sauver l’économie des Etats-Unis d’Amérique.
« Combattre cette crise de santé publique et empêcher l’économie de sombrer dans une dépression nécessitera une énorme quantité de ressources – et si jamais il y avait un temps pour emprunter ces ressources à l’avenir, c’est maintenant », a déclaré MacGuineas.
Traduction : MIRASTNEWS
Source : Sputnik News
Le journaliste Lionel Astruc a enquêté sur la fondation de l’ex-patron de Microsoft, Bill Gates, l’un des hommes les plus riches de la planète. Avec un budget annuel de près de 5 milliards de dollars, et sous prétexte de lutter contre les inégalités, la fondation Gates nourrirait un système destructeur. Entretien.
Saturday, August 06, 2016 by: S. D. Wells
Hitler avait un programme de dépopulation qu’il a gardé secret, jusqu’à ce que tant de millions de personnes disparaissent que le monde commence à comprendre ce qui se passe. Et s’il était sorti tout de suite et avait annoncé son plan de créer une course de maître et d’éliminer tout le monde en leur tirant dans la tête avec deux balles, en les affamant à mort ou en les mettant dans des chambres à gaz?
Combien de personnes dans le monde l’auraient soutenu et ont dit qu’elles aimaient l’idée de se débarrasser de tous les « indésirables » et de les blâmer pour tous les problèmes du monde?
Eh bien, Bill Gates et George Soros s’occupent aussi de dépeuplement, mais il n’y a aucun moyen qu’ils sortent et le disent … ou Bill l’a-t-il déjà fait? Et si vous appreniez en ce moment, par vidéo, que Bill Gates, avec son partenaire dans le crime, prévoyait de réduire la population mondiale d’environ 5 milliards au cours de la prochaine décennie, et qu’ils prévoyaient d’utiliser des vaccins et des aliments génétiquement modifiés pour le faire? C’est ici.
https://www.brighteon.com/embed/5977420425001
https://www.brighteon.com/5977420425001
Les citoyens états-uniens sous-estiment le pouvoir dévastateur de consommer quotidiennement des pesticides. Bien sûr, la plupart des Américains disent vouloir des étiquettes sur les OGM, mais ils ne les obtiendront pas de sitôt, alors maintenant quoi? De plus, la plupart des Américains pensent que les vaccins sont une bonne idée pour lutter contre les maladies infectieuses, et deux personnes sur trois se font vacciner contre la grippe chaque année, mais savent-ils quels sont les ingrédients typiques et quels dommages chroniques ils font vraiment à leur cerveau et les systèmes nerveux, immunitaire et reproducteur?
Bill Gates et George Soros le savent. Ces deux mecs blancs super riches n’essaient pas de sauver les pauvres en Afrique, en Inde ou au Brésil. Ils ne se soucient pas du tout de la santé des sociétés défavorisées, mais ce qui leur importe, c’est de s’assurer que ces gens ne peuvent pas se reproduire, et que s’ils se reproduisent, ils créent des êtres déformés, gravement autistes et atteints de cancer qui ne se reproduira pas ou ne mènera même pas une vie productive, mais coûtera plutôt à ses parents tous leurs revenus et leurs économies juste pour prendre soin d’eux.
Bill Gates a pris la parole lors d’une conférence TED disant qu’il peut réduire la population mondiale de milliards en utilisant des vaccins. Comment? Si les vaccins sont censés prévenir les maladies infectieuses, comment cela équivaut-il à tuer des gens ou à les empêcher de se multiplier? Grande question.
En 2016, on estime que 7 millions de personnes en Afrique du Sud sont séropositives, avec plus de 300 000 nouveaux cas apparaissant chaque année. Parmi ceux-ci, près de 200 000 meurent chaque année d’un décès lié au sida, généralement parce que leur système immunitaire est pratiquement inexistant, de sorte que tout, du rhume à la grippe, pourrait les conduire dans leurs tombes. Quoi d’autre pourrait « tuer » ces « indésirables »? Vaccins contenant des neurotoxines connues et des toxines de métaux lourds. Cela s’appelle l’eugénisme, et de grands gars blancs dirigent le spectacle. Des « essais » sont en cours et Bill Gates, le promoteur ultime du contrôle de la population et philanthrope autoproclamé, injecte de l’argent dans les laboratoires pharmaceutiques pour concocter un vaccin contre le SIDA.
Le CDC définit les vaccins à ADN comme « des préparations plasmidiques purifiées contenant une ou plusieurs séquences d’ADN capables d’induire et / ou de promouvoir une réponse immunitaire contre un pathogène », mais il n’y a aucune preuve que cela fonctionne vraiment comme indiqué, et la recherche montre que lorsque ces séquences sont injectés, ils peuvent provoquer une «mutagenèse insertionnelle», ce qui signifie que des mutations géniques et cellulaires peuvent en résulter – et c’est aussi la définition de la cancérogenèse, ou «cancer». Voulez-vous désactiver vos gènes suppresseurs de tumeurs? Bill Gates et George Soros adoreraient ça si vous le faisiez. Cela pourrait aider à réduire le « problème » de la population mondiale qu’ils luttent si justement pour nous.
Ces nouveaux vaccins à ADN de sondage pourraient-ils réellement créer une tolérance humaine aux agents pathogènes au lieu de l’immunité? Pourquoi les milliardaires qui soutiennent et promeuvent les aliments génétiquement modifiés cancérigènes et chargés de pesticides soutiendraient-ils un vaccin qui crée l’immunité? Cela n’aurait aucun sens. Ce serait comme élever et libérer des millions de serpents venimeux tout en créant et en favorisant l’inoculation anti-venin.
Méfiez-vous des vaccins frauduleux qui contiennent des neurotoxines. Demandez à votre médecin naturopathe si les vaccins hautement expérimentaux, non testés et dangereux Zika, VIH, Ebola, Anthrax, VPH, grippe porcine, ROR et ADN sont « adaptés à vous » et à vos enfants.
Les sources de cet article incluent:
Traduction : MIRASTNEWS
Source : Natural News
Lorsque nous avons commencé, notre peuple a commencé à être menacé. C’était une grave erreur.
Soumettez ce document à tout médecin ou à tout autre spécialiste des sciences biologiques qualifié. Voyez ce qu’ils disent.
Les documents ci-dessous montreront que la recherche pour créer COVID-19 a commencé aux États-Unis d’Amérique en 2006 et a abouti à une bio-arme réussie en 2015, avec des travaux effectués à l’Université de Caroline du Nord et à Harvard et au laboratoire de la Food and Drug Administration en Arkansas.
Leur travail était intitulé:
Ils ont fait cela et bien plus encore, comme vous pourrez le lire ci-dessous.
Comme Trump l’a dit, encore et encore, les Chinois étaient impliqués.
Laboratoire clé des agents pathogènes spéciaux et de la biosécurité, Institut de virologie de Wuhan, Académie chinoise des sciences, Wuhan, la Chine a fourni le virus de la chauve-souris de Wuhan qui a été utilisé dans l’étude états-unienne. Leur nom n’a été inclus que pour cette raison.
COVID 19 était un projet d’armes biologiques de l’armée des Etats-Unis d’Amérique visant à fabriquer une maladie causant une pneumonie qui serait presque impossible à vacciner chez des patients de plus de 40 ans.
La preuve est là, faites simplement défiler vers le bas. L’étude a été dirigée par l’Université de Caroline du Nord et financée par USAID / CIA. Elle a choisi un virus de chauve-souris chinois et a également choisi d’inclure un centre médical à Wuhan.
Maintenant, nous savons pourquoi, un écran de fumée du blâme pour un programme auquel la Chine avait peu ou rien à voir, quelque chose de sataniquement mauvais et purement états-unien.
En novembre 2015, une étude a été publiée décrivant la capacité de produire le virus dont nous traitons actuellement. Parmi les nombreux participants, il y avait un laboratoire à Wuhan, en Chine. Il a été répertorié dès le début comme l’un des dizaines, principalement états-uniennes, travaillant sur ce projet.
Cependant, un participant clé a été laissé de côté, l’USAID. On soupçonne, profondément, que l’USAID est un front pour la recherche des Etats-Unis d’Amérique sur la bio-guerre telle que celle effectuée à Tbilissi, en Géorgie et ailleurs, bien documentée. C’est la citation qui ajoute l’USAID au groupe de financement de la recherche.
20 novembre 2015
Dans la version de cet article initialement publiée en ligne, les auteurs ont omis de mentionner une source de financement, le financement USAID-EPT-PREDICT d’EcoHealth Alliance, à Z.-L.S. L’erreur a été corrigée pour les versions imprimée, PDF et HTML de cet article.
Nous allons maintenant présenter l’article biaisé de Pravda et, ci-dessous, l’étude réelle prouvant la capacité de produire COVID 19, prouvant que ce n’est pas un virus naturel une fois pour toutes.
Quant à savoir qui a fait quoi, ce n’est pas notre travail, mais nous prouvons catégoriquement que lorsqu’un laboratoire chinois est mentionné, il est un acteur mineur dans un effort états-unien [Etat nord-américain. JDDM – MIRASTNEWS], comme indiqué de manière exhaustive ci-dessous.
Cela rend la discussion du laboratoire de Wuhan peut-être complice de la guerre biologique.
De même, lorsque Forbes Magazine et d’autres ont déclaré qu’ils pouvaient prouver que COVID 19 était fabriqué naturellement, et bien sûr, ils avaient le même accès que nous, nous soupçonnons qu’ils font partie d’un effort de désinformation lié à l’USAID et à la guerre biologique.
La suspicion n’est pas une preuve. La preuve est la preuve et il y a suffisamment de preuves pour se noyer. Nos remerciements aux professionnels de la santé des Etats-Unis d’Amérique qui se sont livrés à l’armée états-unienne et à la CIA et qui ont contribué à nous amener là où nous en sommes maintenant, une nation brisée en morceaux.
Pravda.Ru: De tels documents sont apparus en 2015 sur le site Web de la revue scientifique Natura en 2015. Ensuite, les auteurs ont affirmé qu’après l’avènement du virus du SRAS (2002-2003) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS), les scientifiques étaient au courant du risque de transmission interspécifique qui conduirait à une épidémie parmi les populations.
Entre autres choses, l’équipe de recherche a étudié les chauves-souris, qui sont les plus grands incubateurs de coronavirus. Néanmoins, les chauves-souris ne pouvaient pas transmettre le coronavirus à l’homme car elles ne pouvaient pas interagir avec les cellules humaines avec les récepteurs ACE2.
Le matériel a également déclaré que les chauves-souris en fer à cheval sont porteuses d’une souche de coronavirus du SRAS qui peut être transmise à l’homme. Il a été nommé virus SHC014-CoV.
Pour mieux étudier ce virus, les scientifiques ont copié le coronavirus et l’ont infecté avec des souris de laboratoire. Les résultats ont montré que le virus est vraiment capable de se lier aux cellules humaines avec les récepteurs ACE2 et de se multiplier dans les cellules du système respiratoire.
Dans le travail de recherche, il est noté que le matériel, les échantillons et l’équipement de laboratoire qui ont été utilisés dans la recherche ont été obtenus auprès de l’Institut de recherche médicale de l’armée sur les maladies infectieuses. Bien qu’il ne soit pas encore possible de dire avec certitude que le virus qui a été testé sur des souris de laboratoire est le même que le coronavirus SARS-Cove-2.
Cependant, des choses intéressantes peuvent être trouvées dans des documents antérieurs.
Par exemple:
Comme l’écrit le vif de Bruxelles dans la chaîne des télégrammes, «étant donné l’absence de raisons visibles pour un changement aussi marqué des intérêts scientifiques, il y a deux options et les deux sont désagréables:
Oui, la première option est beaucoup plus réelle, mais, voyez-vous, les faits sont surprenants.
Source: Pravda
Recherche originale de 2015 non révisée et terminée
Publié: 09 novembre 2015 Un groupe de coronavirus de chauves-souris circulantes de type SRAS montre un potentiel d’émergence humaine par Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing- Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi, Ralph S Baric
Nature Medicine volume 21, pages 1508-1513 (2015)
Un rectificatif à cet article a été publié le 06 avril 2016
L’émergence du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) -CoV souligne la menace d’événements de transmission entre espèces menant à des épidémies chez l’homme. Ici, nous examinons le potentiel de maladie d’un virus de type SRAS, SHC014-CoV, qui circule actuellement dans les populations de chauves-souris chinoises en fer à cheval1. En utilisant le système de génétique inverse SARS-CoV2, nous avons généré et caractérisé un virus chimérique exprimant le pic du coronavirus de chauve-souris SHC014 dans un squelette SARS-CoV adapté à la souris.
Les résultats indiquent que les virus du groupe 2b codant pour le pic SHC014 dans un squelette de type sauvage peuvent utiliser efficacement plusieurs orthologues de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine II (ACE2), se répliquer efficacement dans les cellules des voies respiratoires humaines primaires et atteindre des titres in vitro équivalents à souches épidémiques du SRAS-CoV. De plus, des expériences in vivo démontrent la réplication du virus chimérique dans le poumon de souris avec une pathogenèse notable.
L’évaluation des modalités immunothérapeutiques et prophylactiques basées sur le SRAS a révélé une faible efficacité; L’anticorps monoclonal et l’approche vaccinale n’ont pas réussi à neutraliser et à protéger contre l’infection par les CoV en utilisant la nouvelle protéine de pointe. Sur la base de ces résultats, nous avons dérivé synthétiquement un virus recombinant infectieux SHC014 de pleine longueur et démontrons une réplication virale robuste à la fois in vitro et in vivo. Nos travaux suggèrent un risque potentiel de réémergence du SRAS-CoV à partir de virus circulant actuellement dans les populations de chauves-souris.
L’émergence du SRAS-CoV a inauguré une nouvelle ère dans la transmission inter-espèces de maladies respiratoires graves, la mondialisation entraînant une propagation rapide dans le monde et un impact économique massif3,4. Depuis lors, plusieurs souches – dont les souches de grippe A H5N1, H1N1 et H7N9 et MERS-CoV – ont émergé des populations animales, provoquant des maladies, une mortalité et des difficultés économiques considérables pour les régions touchées5. Bien que des mesures de santé publique aient pu arrêter l’épidémie de SRAS-CoV4, de récentes études méta-génomiques ont identifié des séquences de virus de type SRAS étroitement apparentés circulant dans les populations de chauves-souris chinoises qui pourraient constituer une menace future1,6.
Cependant, les données de séquence à elles seules fournissent un minimum d’informations pour identifier et préparer les futurs virus pré-pandémiques. Par conséquent, pour examiner le potentiel d’émergence (c’est-à-dire le potentiel d’infecter les humains) des CoV de chauve-souris en circulation, nous avons construit un virus chimérique codant pour une nouvelle protéine de pointe de CoV zoonotique – à partir de la séquence RsSHC014-CoV qui a été isolée des chauves-souris chinoises en fer à cheval1 – dans le cadre du squelette SARS-CoV adapté aux souris. Le virus hybride nous a permis d’évaluer la capacité de la nouvelle protéine de pointe à provoquer des maladies indépendamment des autres mutations adaptatives nécessaires dans son squelette naturel.
En utilisant cette approche, nous avons caractérisé l’infection au CoV médiée par la protéine de pointe SHC014 dans les cellules des voies respiratoires humaines primaires et in vivo et testé l’efficacité des thérapies immunitaires disponibles contre SHC014-CoV. Ensemble, la stratégie traduit les données méta-génomiques pour aider à prévoir et à se préparer aux futurs virus émergents.
Les séquences de SHC014 et du RsWIV1-CoV apparenté montrent que ces CoV sont les plus proches parents des souches épidémiques du SRAS-CoV (Fig. 1a, b); cependant, il existe des différences importantes dans les 14 résidus qui se lient à l’ACE2 humain, le récepteur du SRAS-CoV, y compris les cinq qui sont critiques pour la gamme d’hôtes: Y442, L472, N479, T487 et Y491 (ref. 7).
Dans WIV1, trois de ces résidus diffèrent de la souche épidémique SARS-CoV Urbani, mais on ne s’attendait pas à ce qu’ils altèrent la liaison à ACE2 (Supplementary Fig. 1a,b and Supplementary Table 1). Ce fait est confirmé à la fois par des expériences de pseudotypage qui ont mesuré la capacité des lentivirus codant pour des protéines de pointe WIV1 à pénétrer dans des cellules exprimant l’ACE2 humaine (Fig.1 supplémentaire) et par des tests de réplication in vitro de WIV1-CoV (réf.1). En revanche, 7 des 14 résidus d’interaction ACE2 dans SHC014 sont différents de ceux dans SARS-CoV, y compris les cinq résidus critiques pour la gamme d’hôtes (figure supplémentaire 1c et tableau supplémentaire 1).
Ces changements, couplés à l’échec des lentivirus pseudotypés exprimant la pointe SHC014 à pénétrer dans les cellules (figure supplémentaire 1d), suggèrent que la pointe SHC014 est incapable de se lier à l’ACE2 humain. Cependant, des changements similaires dans les souches associées du SRAS-CoV avaient été signalés pour permettre la liaison de l’ACE27,8, suggérant que des tests fonctionnels supplémentaires étaient nécessaires pour la vérification.
Par conséquent, nous avons synthétisé la pointe SHC014 dans le contexte du squelette SARS-CoV adapté à la réplication et adapté à la souris. (nous désignerons ci-après le CoV chimérique SHC014-MA15) pour maximiser l’opportunité d’études de pathogenèse et de vaccin chez la souris (Fig. 2a supplémentaire). Malgré les prédictions à la fois de la modélisation basée sur la structure et des expériences de pseudotypage, SHC014-MA15 était viable et répliqué à des titres élevés dans les cellules Vero (figure supplémentaire 2b). Semblable au SRAS, SHC014-MA15 nécessitait également une molécule ACE2 fonctionnelle pour l’entrée et pouvait utiliser des orthologues ACE2 humains, civettes et chauves-souris (figure supplémentaire 2c, d).
Pour tester la capacité de la pointe SHC014 à médier l’infection des voies respiratoires humaines, nous avons examiné la sensibilité de la lignée cellulaire des voies respiratoires épithéliales humaines Calu-3 2B4 (ref. 9) à l’infection et trouvé une réplication SHC014-MA15 robuste, comparable à celle de SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). Pour étendre ces résultats, les cultures primaires d’épithélium des voies respiratoires humaines (AOH) ont été infectées et ont montré une réplication robuste des deux virus (Fig. 1d). Ensemble, les données confirment la capacité des virus avec la pointe SHC014 à infecter les cellules des voies respiratoires humaines et soulignent la menace potentielle de transmission inter-espèces de SHC014-CoV.
Figure 1: Les virus de type SRAS se répliquent dans les cellules des voies respiratoires humaines et produisent une pathogenèse in vivo.
(a) Les séquences du génome sur toute la longueur des CoV représentatifs ont été alignées et cartographiées phylogénétiquement comme décrit dans les Méthodes en ligne. La barre d’échelle représente les substitutions de nucléotides, avec seulement un support bootstrap supérieur à 70% étant marqué. L’arbre montre les CoV divisés en trois groupes phylogénétiques distincts, définis comme α-CoV, β-CoV et γ-CoV. Les grappes de sous-groupes classiques sont marquées comme 2a, 2b, 2c et 2d pour les β-CoV et comme 1a et 1b pour les α-CoV. (b) Les séquences d’acides aminés des domaines S1 des pointes des β-CoV représentatifs du groupe 2b, y compris le SARS-CoV, ont été alignées et cartographiées phylogénétiquement. La barre d’échelle représente les substitutions d’acides aminés. (c, d) Réplication virale de SARS-CoV Urbani (noir) et SHC014-MA15 (vert) après infection de cellules Calu-3 2B4 (c) ou cultures de cellules HAE à interface air-liquide primaire bien différenciées (d) à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,01 pour les deux types de cellules. Des échantillons ont été prélevés à des moments individuels avec des répliques biologiques (n = 3) pour les expériences Calu-3 et HAE. (e, f) Perte de poids (n = 9 pour SARS-CoV MA15; n = 16 pour SHC014-MA15) (e) et réplication virale dans les poumons (n = 3 pour SARS-CoV MA15; n = 4 pour SHC014- MA15) (f) de souris BALB / c âgées de 10 semaines infectées par 1 × 104 pfu de SARS-CoV MA15 adapté aux souris (noir) ou SHC014-MA15 (vert) par voie intranasale (i.n.). (g, h) Des images représentatives de coupes pulmonaires colorées pour l’antigène SARS-CoV N de souris infectées par SARS-CoV MA15 (n = 3 souris) (g) ou SHC014-MA15 (n = 4 souris) (h) sont montrées. Pour chaque graphique, la valeur centrale représente la moyenne du groupe et les barres d’erreur définissent la valeur s.e.m. Barres d’échelle, 1 mm.
Pour évaluer le rôle du pic SHC014 dans la médiation de l’infection in vivo, nous avons infecté des souris BALB / c âgées de 10 semaines avec 104 unités formatrices de plaque (pfu) de SARS-MA15 ou SHC014-MA15 (Fig. 1e–h) . Les animaux infectés par le SRAS-MA15 ont connu une perte de poids rapide et une létalité 4 jours après l’infection (d.p.i.); en revanche, l’infection par SHC014-MA15 a entraîné une perte de poids substantielle (10%) mais aucune létalité chez la souris (Fig. 1e). L’examen de la réplication virale a révélé des titres viraux presque équivalents dans les poumons de souris infectées par le SRAS-MA15 ou SHC014-MA15 (Fig. 1f). Alors que les poumons des souris infectées par le SRAS-MA15 présentaient une coloration robuste à la fois dans les bronchioles terminales et dans le parenchyme pulmonaire 2 d.p.i. (Fig. 1g), celles des souris infectées par SHC014-MA15 ont montré une diminution de la coloration de l’antigène des voies respiratoires (Fig. 1h); en revanche, aucun déficit de coloration antigénique n’a été observé dans le parenchyme ou dans le score histologique global, suggérant une infection différentielle du tissu pulmonaire pour SHC014-MA15 (tableau supplémentaire 2). Nous avons ensuite analysé l’infection chez des animaux âgés (12 mois) plus sensibles. Les animaux infectés par le SRAS-MA15 ont rapidement perdu du poids et succombé à l’infection (figure supplémentaire 3a, b). L’infection par SHC014-MA15 a induit une perte de poids robuste et soutenue, mais avait une létalité minimale. Les tendances de l’histologie et des profils de coloration de l’antigène que nous avons observées chez les jeunes souris ont été conservées chez les animaux plus âgés (tableau supplémentaire 3). Nous avons exclu la possibilité que SHC014-MA15 soit médiatrice de l’infection par un récepteur alternatif sur la base d’expériences utilisant des souris Ace2 – / -, qui n’ont pas montré de perte de poids ou de coloration d’antigène après une infection par SHC014-MA15 (Supplementary Fig. 4a,b and Supplementary Table 2). Ensemble, les données indiquent que les virus avec le pic SHC014 sont capables d’induire une perte de poids chez la souris dans le cadre d’un squelette CoV virulent.
Compte tenu de l’efficacité préclinique des thérapies par anticorps monoclonaux contre Ebola, telles que ZMApp10, nous avons ensuite cherché à déterminer l’efficacité des anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV contre l’infection par SHC014-MA15. Quatre anticorps monoclonaux humains largement neutralisants ciblant la protéine de pointe du SRAS-CoV avaient déjà été signalés et sont des réactifs probables pour l’immunothérapie11,12,13.. Nous avons examiné l’effet de ces anticorps sur la réplication virale (exprimé en pourcentage d’inhibition de la réplication virale) et avons constaté que, alors que le SARS-CoV Urbani de type sauvage était fortement neutralisé par les quatre anticorps à des concentrations d’anticorps relativement faibles (Fig. 2a–d), la neutralisation variait pour SHC014-MA15. Le Fm6, un anticorps généré par l’affichage des phages et les mutants d’échappement11,12, n’a atteint que des niveaux de fond d’inhibition de la réplication SHC014-MA15 (Fig. 2a). De même, les anticorps 230.15 et 227.14, qui étaient dérivés de cellules mémoire B de patients infectés par le SRAS-CoV13, n’ont pas non plus bloqué la réplication de SHC014-MA15 (Fig. 2b,c). Pour les trois anticorps, les différences entre les séquences d’acides aminés des pics SARS et SHC014 correspondaient à des changements de résidus directs ou adjacents trouvés dans les mutants d’échappement SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E), ce qui explique probablement l’absence des anticorps ‘activité neutralisante contre SHC014. Enfin, l’anticorps monoclonal 109.8 a pu atteindre une neutralisation à 50% de SHC014-MA15, mais uniquement à des concentrations élevées (10 μg / ml) (Fig. 2d). Ensemble, les résultats démontrent que les anticorps neutralisants à grande échelle contre le SRAS-CoV ne peuvent avoir qu’une efficacité marginale contre les souches émergentes de CoV de type SRAS telles que SHC014.
Figure 2: Les anticorps monoclonaux contre le SRAS-CoV ont une efficacité marginale contre les CoV de type SRAS.
(a – d) Essais de neutralisation évaluant l’efficacité (mesurée en tant que réduction du nombre de plaques) d’un panel d’anticorps monoclonaux, qui ont tous été générés à l’origine contre le SRAS-CoV épidémique, contre l’infection des cellules Vero par le SARS-CoV Urbani (noir) ou SHC014-MA15 (vert). Les anticorps testés étaient fm6 (n = 3 pour Urbani; n = 5 pour SHC014-MA15) 11,12 (a), 230,15 (n = 3 pour Urbani; n = 2 pour SHC014-MA15) (b), 227,15 (n = 3 pour Urbani; n = 5 pour SHC014-MA15) (c) et 109,8 (n = 3 pour Urbani; n = 2 pour SHC014-MA15) 13 (d). Chaque point de données représente la moyenne du groupe et les barres d’erreur définissent la valeur s.e.m. Notez que les barres d’erreur dans les cellules Vero infectées par le SRAS-CoV Urbani en b, c sont superposées par les symboles et ne sont pas visibles.
Pour évaluer l’efficacité des vaccins existants contre l’infection par SHC014-MA15, nous avons vacciné des souris âgées avec du SARS-CoV (DIV) entier double-inactivé. Des travaux antérieurs ont montré que DIV pouvait neutraliser et protéger les jeunes souris contre la provocation par un virus homologue14; cependant, le vaccin n’a pas réussi à protéger les animaux âgés chez lesquels une pathologie immunitaire augmentée a également été observée, indiquant la possibilité que les animaux soient blessés en raison de la vaccination15. Ici, nous avons constaté que DIV n’a pas fourni de protection contre la provocation avec SHC014-MA15 en ce qui concerne la perte de poids ou le titre viral (Fig. Supplémentaire 5a, b). Conformément à un rapport précédent avec d’autres CoVs15 hétérologues du groupe 2b, le sérum de souris âgées vaccinées par DIV n’a pas non plus neutralisé SHC014-MA15 (figure supplémentaire 5c). Notamment, la vaccination DIV a entraîné une pathologie immunitaire robuste (tableau supplémentaire 4) et une éosinophilie (figure supplémentaire 5d – f). Ensemble, ces résultats confirment que le vaccin DIV ne protégerait pas contre l’infection par SHC014 et pourrait éventuellement augmenter la maladie dans le groupe vacciné âgé.
Contrairement à la vaccination des souris avec DIV, l’utilisation de SHC014-MA15 en tant que vaccin vivant atténué a montré une protection croisée potentielle contre la provocation par le SRAS-CoV, mais les résultats comportent d’importantes réserves. Nous avons infecté de jeunes souris avec 104 p.f.u. de SHC014-MA15 et les a observés pendant 28 jours. Nous avons ensuite provoqué les souris avec SARS-MA15 au jour 29 (figure supplémentaire 6a). L’infection antérieure des souris par la dose élevée de SHC014-MA15 a conféré une protection contre la provocation par une dose létale de SRAS-MA15, bien qu’il n’y ait eu qu’une réponse de neutralisation minimale du SRAS-CoV des antisérums déclenchée 28 jours après l’infection par SHC014-MA15 (Fig.6b supplémentaire, 1: 200). En l’absence de rappel d’antigène secondaire, 28 d.p.i. représente le pic attendu des titres d’anticorps et implique que la protection contre le SRAS-CoV diminuera avec le temps16,17. Des résultats similaires montrant une protection contre la provocation avec une dose létale de SARS-CoV ont été observés chez des souris BALB / c âgées en ce qui concerne la perte de poids et la réplication virale (figure supplémentaire 6c, d). Cependant, la dose d’infection SHC014-MA15 de 104 p.f.u. induit> 10% de perte de poids et de létalité chez certains animaux âgés (Fig. 1 et Fig. 3 supplémentaire). Nous avons constaté que la vaccination avec une dose plus faible de SHC014-MA15 (100 p.f.u.), n’induisait pas de perte de poids, mais elle ne protégeait pas non plus les animaux âgés d’une provocation par la dose létale du SRAS-MA15 (figure supplémentaire 6e, f). Ensemble, les données suggèrent que la provocation par SHC014-MA15 peut conférer une protection croisée contre le SRAS-CoV par le biais d’épitopes conservés, mais la dose requise induit la pathogenèse et empêche l’utilisation comme vaccin atténué.
Après avoir établi que la pointe SHC014 a la capacité de médier l’infection des cellules humaines et de provoquer des maladies chez la souris, nous avons ensuite synthétisé un clone infectieux SHC014-CoV de pleine longueur basé sur l’approche utilisée pour le SRAS-CoV (Fig. 3a)2. La réplication dans les cellules Vero n’a révélé aucun déficit pour SHC014-CoV par rapport à celui pour SARS-CoV (Fig. 3b); cependant, SHC014-CoV était significativement (P <0,01) atténué dans les cultures primaires d’AOH à la fois 24 et 48 h après l’infection (Fig. 3c). L’infection in vivo de souris n’a montré aucune perte de poids significative mais a montré une réplication virale réduite dans les poumons de l’infection SHC014-CoV complète, par rapport au SARS-CoV Urbani (Fig. 3d,e). Ensemble, les résultats établissent la viabilité du SHC014-CoV de pleine longueur, mais suggèrent qu’une adaptation supplémentaire est nécessaire pour que sa réplication soit équivalente à celle du SARS-CoV épidémique dans les cellules respiratoires humaines et chez la souris.
Figure 3: SHC014-CoV pleine longueur se réplique dans les voies respiratoires humaines mais n’a pas la virulence du SRV-CoV épidémique.
(a) Schéma du clone moléculaire SHC014-CoV, qui a été synthétisé sous la forme de six ADNc contigus (désignés SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E et SHC014F) flanqués de sites BglI uniques qui ont permis l’assemblage dirigé de l’ADNc pleine longueur exprimant cadres de lecture ouverts (pour 1a, 1b, pic, 3, enveloppe, matrice, 6–8 et nucléocapside). Les nucléotides soulignés représentent les séquences en surplomb formées après le clivage de l’enzyme de restriction. (b, c) Réplication virale de SARS-CoV Urbani (noir) ou SHC014-CoV (vert) après infection de cellules Vero (b) ou cultures de cellules HAE à interface air-liquide primaire bien différenciées (c) à un MOI de 0,01. Des échantillons ont été prélevés à des moments individuels avec des répliques biologiques (n = 3) pour chaque groupe. Les données représentent une expérience pour les cellules Vero et HAE. (d, e) Perte de poids (n = 3 pour SARS-CoV MA15, n = 7 pour SHC014-CoV; n = 6 pour SARS-Urbani) (d) et réplication virale dans les poumons (n = 3 pour SARS-Urbani et SHC014-CoV) (e) de souris BALB / c âgées de 10 semaines infectées par 1 × 105 pfu de SARS-CoV MA15 (gris), SHC014-CoV (vert) ou SARS-CoV Urbani (noir) via le i.n. route. Chaque point de données représente la moyenne du groupe et des barres d’erreur définissent la valeur s.e.m. ** P <0,01 et *** P <0,001 en utilisant le test t de Student bilatéral de points temporels individuels.
Pendant l’épidémie de SRAS-CoV, des liens ont été rapidement établis entre les civettes de palmier et les souches de CoV détectées chez l’homme4. S’appuyant sur cette découverte, le paradigme d’émergence commun soutient que le SRAS-CoV épidémique est originaire d’un virus de chauve-souris, a sauté aux civettes et a incorporé des changements dans le domaine de liaison aux récepteurs (RBD) pour améliorer la liaison à la civette Ace2 (ref. 18). Une exposition ultérieure à des personnes sur les marchés d’animaux vivants a permis à l’infection humaine de souche civette, qui, à son tour, s’est adaptée pour devenir la souche épidémique (Fig. 4a). Cependant, l’analyse phylogénétique suggère que les premières souches humaines du SRAS semblent plus étroitement liées aux souches de chauves-souris qu’aux souches de civette18. Par conséquent, un deuxième paradigme fait valoir que la transmission directe entre la chauve-souris et l’homme a déclenché l’émergence du SRAS-CoV et que les civettes de palmier ont servi d’hôte secondaire et de réservoir pour une infection continue (Fig. 4b)19. Pour les deux paradigmes, l’adaptation des pointes chez un hôte secondaire est considérée comme une nécessité, la plupart des mutations devant se produire dans le RBD, facilitant ainsi une infection améliorée. Les deux théories impliquent que les pools de CoV des chauves-souris sont limités et que les mutations de la gamme d’hôtes sont à la fois aléatoires et rares, réduisant la probabilité de futurs événements d’émergence chez l’homme.
Figure 4: Paradigmes d’émergence pour les coronavirus.
Les souches de coronavirus sont maintenues dans des pools de quasi-espèces circulant dans les populations de chauves-souris. (a, b) Les théories traditionnelles sur l’émergence du SRAS-CoV supposent que les mutants de la gamme d’hôtes (cercle rouge) représentent des occurrences aléatoires et rares qui permettent l’infection d’hôtes alternatifs. Le paradigme de l’hôte secondaire (a) soutient qu’un hôte non humain est infecté par un virus progéniteur de chauve-souris et, par l’adaptation, facilite la transmission à l’homme; la réplication ultérieure chez l’homme conduit à la souche virale épidémique. Le paradigme direct (b) suggère que la transmission se produit entre les chauves-souris et les humains sans avoir besoin d’un hôte intermédiaire; la sélection se produit alors dans la population humaine avec des virus étroitement apparentés se répliquant dans un hôte secondaire, permettant une persistance et une adaptation virales continues dans les deux. (c) Les données des virus chimériques de type SRAS soutiennent que les pools de quasi-espèces maintiennent plusieurs virus capables d’infecter les cellules humaines sans avoir besoin de mutations (cercles rouges). Bien que des adaptations chez des hôtes secondaires ou humains puissent être nécessaires pour l’émergence d’une épidémie, si des virus contenant des pointes SHC014 sont recombinés avec des squelettes CoV virulents (cercles avec des contours verts), alors la maladie épidémique peut être le résultat chez l’homme. Les données existantes prennent en charge les éléments des trois paradigmes.
Bien que notre étude n’invalide pas les autres voies d’émergence, elle plaide pour un troisième paradigme dans lequel les pools de CoV de chauves-souris en circulation maintiennent des protéines de pointe « en équilibre » qui sont capables d’infecter les humains sans mutation ni adaptation (Fig. 4c). Cette hypothèse est illustrée par la capacité d’un virus chimérique contenant la pointe SHC014 dans un squelette SARS-CoV à provoquer une infection robuste dans les cultures des voies respiratoires humaines et chez les souris sans adaptation RBD.
Couplés à l’observation de squelettes CoV pathogènes précédemment identifiés3,20, nos résultats suggèrent que les matériaux de départ requis pour les souches émergentes de type SRAS circulent actuellement dans des réservoirs d’animaux. Notamment, bien que SHC014-CoV de pleine longueur nécessite probablement une adaptation supplémentaire du squelette pour médier la maladie humaine, les événements de recombinaison à haute fréquence documentés dans les familles de CoV soulignent la possibilité d’émergence future et la nécessité d’une préparation supplémentaire.
À ce jour, les dépistages génomiques des populations animales ont été principalement utilisés pour identifier de nouveaux virus dans les foyers21. L’approche ici étend ces ensembles de données pour examiner les questions d’émergence virale et d’efficacité thérapeutique. Nous considérons les virus avec le pic SHC014 comme une menace potentielle en raison de leur capacité à se répliquer dans les cultures primaires des voies respiratoires humaines, le meilleur modèle disponible pour les maladies humaines. De plus, la pathogenèse observée chez la souris indique une capacité des virus contenant SHC014 à provoquer des maladies dans les modèles mammifères, sans adaptation RBD.
Notamment, le tropisme différentiel dans le poumon par rapport à celui avec le SRAS-MA15 et l’atténuation du SHC014-CoV de pleine longueur dans les cultures d’AOH par rapport au SARS-CoV Urbani suggèrent que des facteurs au-delà de la liaison ACE2, y compris la processivité des pointes, la biodisponibilité des récepteurs ou l’antagonisme des réponses immunitaires de l’hôte – peut contribuer à l’émergence. Cependant, des tests supplémentaires sur des primates non humains sont nécessaires pour traduire ces résultats en potentiel pathogène chez l’homme. Surtout, l’échec des thérapies disponibles définit un besoin critique pour une étude plus approfondie et pour le développement de traitements. Grâce à ces connaissances, des programmes de surveillance, des réactifs de diagnostic et des traitements efficaces peuvent être produits qui protègent contre l’émergence de CoV spécifiques au groupe 2b, tels que SHC014, et ceux-ci peuvent être appliqués à d’autres branches de CoV qui maintiennent des pools hétérogènes similaires.
En plus d’offrir une préparation contre les futurs virus émergents, cette approche doit être considérée dans le contexte de la pause imposée par le gouvernement américain sur les études de gain de fonction (GOF)22. Sur la base des modèles d’émergence précédents (Fig. 4a,b), la création de virus chimériques tels que SHC014-MA15 ne devrait pas augmenter la pathogénicité. Bien que SHC014-MA15 soit atténué par rapport à son SARS-CoV adapté à la souris parentale, des études similaires examinant la pathogénicité des CoV avec la pointe Urbani de type sauvage dans le squelette MA15 n’ont montré aucune perte de poids chez la souris et une réplication virale réduite23. Ainsi, par rapport au pic Urbani – CoV MA15, SHC014-MA15 montre un gain de pathogenèse(Fig. 1). Sur la base de ces résultats, les comités d’examen scientifique peuvent juger des études similaires sur la construction de virus chimériques basés sur des souches en circulation trop risquées, car une pathogénicité accrue dans les modèles mammifères ne peut être exclue.
Couplé à des restrictions sur les souches adaptées à la souris et au développement d’anticorps monoclonaux utilisant des mutants d’échappement, la recherche sur l’émergence de CoV et l’efficacité thérapeutique pourrait être sérieusement limitée à l’avenir. Ensemble, ces données et restrictions représentent un carrefour des préoccupations de recherche du GOF; le potentiel de préparation et d’atténuation des flambées futures doit être mis en balance avec le risque de création d’agents pathogènes plus dangereux. Lors de l’élaboration de politiques à l’avenir, il est important de tenir compte de la valeur des données générées par ces études et de savoir si ces types d’études sur le virus chimérique justifient une enquête plus approfondie par rapport aux risques inhérents impliqués.
Dans l’ensemble, notre approche a utilisé des données de métagénomique pour identifier une menace potentielle posée par la chauve-souris circulante de type SRV CoC SHC014. En raison de la capacité des virus chimériques SHC014 à se répliquer dans les cultures des voies respiratoires humaines, à provoquer une pathogenèse in vivo et à échapper aux thérapies actuelles, il existe un besoin à la fois de surveillance et de thérapies améliorées contre les virus de type SRAS en circulation. Notre approche permet également de débloquer l’utilisation des données métagénomiques pour prédire l’émergence virale et d’appliquer ces connaissances dans la préparation du traitement des futures infections virales émergentes.
Virus, cellules, infection in vitro et tests sur plaque.
Le SARS-CoV de type sauvage (Urbani), le SARS-CoV adapté aux souris (MA15) et les CoV chimériques de type SARS ont été cultivés sur des cellules Vero E6 (obtenues auprès de l’Institut de recherche médicale des États-Unis sur les maladies infectieuses), cultivées dans le Eagle’s modifié de Dulbecco. moyen (DMEM) (Gibco, CA) et 5% de sérum de clone fœtal (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) avec un antibiotique / antimycotique (Gibco, Carlsbad, CA). Des cellules DBT (laboratoire barique, source inconnue) exprimant des orthologues ACE2 ont été précédemment décrites pour l’homme et la civette; la séquence bat Ace2 était basée sur celle de Rhinolophus leschenaulti, et les cellules DBT exprimant la batte Ace2 ont été établies comme décrit précédemment8.
Les expériences de pseudotypage étaient similaires à celles utilisant un pseudovirus basé sur le VIH, préparées comme décrit précédemment10, et examinées sur des cellules HeLa (Wuhan Institute of Virology) qui exprimaient des orthologues ACE2. Les cellules HeLa ont été cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM) (Gibco, CA) additionné de 10% de FCS (Gibco, CA) comme décrit précédemment24.
Les courbes de croissance dans Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 et les cellules épithéliales des voies aériennes humaines primaires ont été réalisées comme décrit précédemment8,25. Aucun des stocks de lignées cellulaires de travail n’a été authentifié ou testé pour les mycoplasmes récemment, bien que les stocks de semences d’origine utilisés pour créer les stocks de travail soient exempts de contamination. Les poumons humains pour les cultures d’AOH ont été acquis en vertu des protocoles approuvés par le Chapel Hill Institutional Review Board de l’Université de Caroline du Nord. Les cultures d’AOH représentent un épithélium des voies respiratoires humaines hautement différencié contenant des cellules épithéliales ciliées et non ciliées ainsi que des cellules caliciformes. Les cultures sont également cultivées sur une interface air-liquide pendant plusieurs semaines avant utilisation, comme décrit précédemment26.
En bref, les cellules ont été lavées avec du PBS et inoculées avec du virus ou simulées diluées dans du PBS pendant 40 min à 37° C. Après l’inoculation, les cellules ont été lavées trois fois et du milieu frais a été ajouté pour indiquer le temps «0». Trois réplicats biologiques ou plus ont été récoltés à chaque moment décrit. Aucun aveuglement n’a été utilisé dans les collections d’échantillons ni les échantillons ont été randomisés. Toute la culture du virus a été réalisée dans un laboratoire de niveau de biosécurité (BSL) 3 avec des ventilateurs redondants dans les armoires de biosécurité, comme décrit précédemment par notre groupe2. Tout le personnel portait des respirateurs à adduction d’air filtré (Breathe Easy, 3M) avec des combinaisons, des tabliers et des bottillons Tyvek et portait un double gant.
Regroupement de séquences et modélisation structurale.
Les séquences génomiques complètes et les séquences d’acides aminés des domaines S1 du pic de CoV représentatifs ont été téléchargées à partir de Genbank ou Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), alignées avec ClustalX et comparées phylogénétiquement en utilisant l’estimation de la probabilité maximale à l’aide de 100 bootstrap ou en en utilisant respectivement le package PhyML (https://code.google.com/p/phyml/). L’arbre a été généré en utilisant le maximum de vraisemblance avec le package PhyML. La barre d’échelle représente les substitutions de nucléotides. Seuls les nœuds avec un support d’amorçage supérieur à 70% sont étiquetés.
L’arbre montre que les CoV sont divisés en trois groupes phylogénétiques distincts définis comme α-CoV, β-CoV et γ-CoV. Les grappes de sous-groupes classiques sont marquées 2a, 2b, 2c et 2d pour les β-CoV et 1a et 1b pour les α-CoV. Des modèles structurels ont été générés à l’aide de Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) pour générer des modèles d’homologie pour SHC014 et Rs3367 du SARS RBD en complexe avec ACE2 sur la base de la structure cristalline 2AJF (Protein Data Bank). Les modèles d’homologie ont été visualisés et manipulés dans MacPyMol (version 1.3).
Construction de virus chimériques de type SRAS.
Les virus de type sauvage et chimériques ont été dérivés soit du SARS-CoV Urbani, soit du clone infectieux (ic) adapté à la souris (SARS-CoV MA15), comme décrit précédemment27. Les plasmides contenant des séquences de pointes pour SHC014 ont été extraits par digestion de restriction et ligaturés dans les plasmides E et F du clone infectieux MA15. Le clone a été conçu et acheté auprès de Bio Basic sous la forme de six ADNc contigus en utilisant des séquences publiées flanquées de sites d’endonucléases de restriction de classe II uniques (Bgll). Par la suite, des plasmides contenant des fragments de génome de type sauvage, SARS-CoV et SHC014-CoV de type sauvage ont été amplifiés, excisés, ligaturés et purifiés.
Les réactions de transcription in vitro ont ensuite été préformées pour synthétiser l’ARN génomique complet, qui a été transfecté dans les cellules Vero E6 comme décrit précédemment2. Le milieu des cellules transfectées a été récolté et a servi de stock de semences pour les expériences ultérieures. Les virus chimériques et de pleine longueur ont été confirmés par analyse de séquence avant utilisation dans ces études. La construction synthétique du mutant chimérique et du SHC014-CoV pleine longueur a été approuvée par le comité de biosécurité institutionnelle de l’Université de Caroline du Nord et le comité de recherche préoccupante à double usage.
Déclaration d’éthique.
Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations pour le soin et l’utilisation des animaux par l’Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW), NIH. Le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC, numéro de permis A-3410-01) a approuvé le protocole d’étude sur les animaux (IACUC # 13-033) utilisé dans ces études.
Souris et infection in vivo.
Des souris BALB / cAnNHsD âgées de 10 semaines et 12 mois ont été commandées auprès des Laboratoires Harlan. Les infections de souris ont été effectuées comme décrit précédemment20. En bref, les animaux ont été amenés dans un laboratoire BSL3 et autorisés à s’acclimater pendant 1 semaine avant l’infection. Pour l’infection et la vaccination contre le virus vivant atténué, les souris ont été anesthésiées avec un mélange de kétamine et de xylazine et infectées par voie intranasale, en cas de provocation, avec 50 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou virus dilué avec trois ou quatre souris par point dans le temps, par groupe d’infection par dose comme décrit dans les légendes des figures.
Pour les souris individuelles, les notations d’infection, notamment le fait de ne pas inhaler la totalité de la dose, le bouillonnement de l’inoculum par le nez ou l’infection par la bouche, peuvent avoir conduit à l’exclusion des données de souris à la discrétion du chercheur; post-infection, aucun autre critère d’exclusion ou d’inclusion préétabli n’est défini. Aucun aveuglement n’a été utilisé dans les expériences animales et les animaux n’ont pas été randomisés. Pour la vaccination, les souris jeunes et âgées ont été vaccinées par injection de coussinets plantaires avec un volume de 20 μl de 0,2 μg de vaccin SRAS-CoV double-inactivé avec de l’alun ou du faux PBS; les souris ont ensuite été boostées avec le même régime 22 jours plus tard et provoquées 21 jours par la suite. Pour tous les groupes, selon le protocole, les animaux ont été surveillés quotidiennement pour les signes cliniques de maladie (courbure, fourrure ébouriffée et activité réduite) pendant la durée de l’expérience. La perte de poids a été surveillée quotidiennement pendant les 7 premiers jours, après quoi la surveillance du poids s’est poursuivie jusqu’à ce que les animaux retrouvent leur poids de départ initial ou affichent une prise de poids continue pendant 3 jours.
Toutes les souris qui ont perdu plus de 20% de leur poids corporel de départ ont été nourries au sol et surveillées plusieurs fois par jour tant qu’elles étaient sous la limite de 20%. Les souris qui ont perdu plus de 30% de leur poids corporel de départ ont été immédiatement sacrifiées selon le protocole. Toute souris jugée moribonde ou peu susceptible de se remettre a également été sacrifiée sans cruauté à la discrétion du chercheur. L’euthanasie a été réalisée à l’aide d’une surdose d’isoflurane et la mort a été confirmée par luxation cervicale. Toutes les études sur la souris ont été réalisées à l’Université de Caroline du Nord (assurance du bien-être animal # A3410-01) en utilisant des protocoles approuvés par le Comité UNC Institutional Animal Care and Use (IACUC).
Analyse histologique.
Le poumon gauche a été retiré et immergé dans du formol tamponné à 10% (Fisher) sans gonflement pendant 1 semaine. Les tissus ont été inclus dans de la paraffine et des coupes de 5 μm ont été préparées par le centre d’histopathologie UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Pour déterminer l’étendue de la coloration de l’antigène, des coupes ont été colorées pour l’antigène viral en utilisant un anticorps anti-nucléocapside polyclonal SARS-CoV disponible dans le commerce (Imgenex) et notées de manière aveugle par pour la coloration des voies respiratoires et du parenchyme comme décrit précédemment20. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope Olympus BX41 avec une caméra Olympus DP71.
Essais de neutralisation de virus.
Des tests de titre de neutralisation de la réduction de la plaque ont été réalisés avec des anticorps précédemment caractérisés contre le SRAS-CoV, comme décrit précédemment11,12,13. En bref, les anticorps neutralisants ou le sérum ont été dilués en série en deux et incubés avec 100 p.f.u. des différentes souches infectieuses du clone SARS-CoV pendant 1 h à 37° C. Le virus et les anticorps ont ensuite été ajoutés à une plaque à 6 puits avec 5 × 105 cellules Vero E6 / puits avec plusieurs répétitions (n ≥ 2). Après une incubation d’une heure à 37° C, les cellules ont été recouvertes de 3 ml d’agarose à 0,8% dans le milieu. Les plaques ont été incubées pendant 2 jours à 37° C, colorées au rouge neutre pendant 3 h et les plaques ont été comptées. Le pourcentage de réduction de la plaque a été calculé comme (1 – (nombre de plaques avec anticorps / nombre de plaques sans anticorps)) × 100.
Analyses statistiques.
Toutes les expériences ont été menées en contrastant deux groupes expérimentaux (soit deux virus, soit des cohortes vaccinées et non vaccinées). Par conséquent, des différences significatives dans le titre viral et la notation histologique ont été déterminées par un test t de Student bilatéral à des moments individuels. Les données étaient normalement distribuées dans chaque groupe comparé et présentaient une variance similaire.
Biosécurité et biosécurité.
Les études signalées ont été lancées après l’approbation du protocole expérimental par le Comité institutionnel de biosécurité de l’Université de Caroline du Nord (Titre du projet: Génération de clones infectieux de CoV de type SARS de chauve-souris; ID de plan de sécurité de laboratoire: 20145741; annexe G ID: 12279). Ces études ont été lancées avant la pause du financement de la recherche sur le processus délibératif du gouvernement américain sur certaines recherches sur le gain de fonction impliquant les virus de la grippe, du MERS et du SRAS (http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function .pdf). Ce document a été examiné par l’agence de financement, le NIH. La poursuite de ces études a été demandée, ce qui a été approuvé par le NIH.
SARS-CoV est un agent sélectif. Tout le travail pour ces études a été effectué avec des procédures opératoires normalisées (SOP) et des conditions de sécurité approuvées pour le SRAS-CoV, le MERs-CoV et d’autres CoV associés. Nos installations institutionnelles CoV BSL3 ont été conçues pour se conformer aux exigences de sécurité recommandées par les laboratoires de biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL), le département américain de la Santé et des Services sociaux, le service de santé publique, les Centers for Disease Control (CDC). ) et le NIH. Des plans de sécurité en laboratoire ont été soumis au Département de la santé et de la sécurité de l’environnement (EHS) de l’UNC et au CDC et leur utilisation a été approuvée. Un accès par carte électronique est requis pour entrer dans l’établissement.
Tous les travailleurs ont été formés par EHS à utiliser en toute sécurité des respirateurs à adduction d’air filtré (PAPR), et des habitudes de travail appropriées dans un établissement BSL3 et des plans de surveillance médicale active sont en place. Nos installations CoV BSL3 contiennent des ventilateurs redondants, l’alimentation de secours des ventilateurs et des armoires de sécurité biologique et des congélateurs, et nos installations peuvent accueillir des racks de souris SealSafe. Les matériaux classés comme agents BSL3 sont constitués de souches de précurseurs du SRAS-CoV, de bat CoV, de MERS-CoV et de mutants dérivés de ces agents pathogènes. Dans les installations BSL3, l’expérimentation d’un virus infectieux est réalisée dans une armoire de biosécurité certifiée de classe II (BSC).
Tous les membres du personnel portent des gommages, des costumes et des tabliers Tyvek, des PAPR et des couvre-chaussures, et leurs mains sont à double gant. Les utilisateurs de BSL3 sont soumis à un plan de surveillance médicale surveillé par la Clinique de santé au travail des employés de l’Université (UEOHC), qui comprend une vaccination annuelle contre la grippe physique et annuelle et la déclaration obligatoire de tout symptôme associé à l’infection à CoV pendant les périodes de travail dans le BSL3. Tous les utilisateurs de BSL3 sont formés à la gestion de l’exposition et aux protocoles de déclaration, sont prêts à s’auto-mettre en quarantaine et ont été formés pour une livraison en toute sécurité à un service local de gestion des maladies infectieuses en cas d’urgence. Tous les événements d’exposition potentiels sont signalés et examinés par l’EHS et l’UEOHC, avec des rapports déposés à la fois au CDC et au NIH.
Dans la version de cet article initialement publiée en ligne, les auteurs ont omis de mentionner une source de financement, le financement USAID-EPT-PREDICT d’EcoHealth Alliance, à Z.-L.S. L’erreur a été corrigée pour les versions imprimée, PDF et HTML de cet article.
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La recherche dans ce manuscrit a été financée par des subventions du National Institute of Allergy & Infectious Disease et du National Institute of Aging des États-Unis National Institutes of Health (NIH) dans le cadre des bourses U19AI109761 (RSB), U19AI107810 (RSB), AI085524 (WAM), F32AI102561 (VDM) et K99AG049092 (VDM), et par la National Natural Science Foundation of China attribue 81290341 (Z.-LS) et 31470260 (X.-YG), et par le financement USAID-EPT-PREDICT d’EcoHealth Alliance (Z. -LS). Les cultures épithéliales des voies respiratoires humaines ont été soutenues par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales du NIH sous le prix NIH DK065988 (S.H.R.). Nous remercions également M.T. Ferris (Dept. of Genetics, University of North Carolina) pour l’examen des approches statistiques et C.T. Tseng (Dept. of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch) pour avoir fourni des cellules Calu-3. Des expériences avec les virus recombinants SHC014 pleine longueur et chimériques ont été lancées et effectuées avant la pause de financement de la recherche du GOF et ont depuis été examinées et approuvées pour une étude continue par le NIH. Le contenu est sous la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles du NIH.
Duff has traveled extensively, is published around the world and is a regular guest on TV and radio in more than “several” countries. He is also a trained chef, wine enthusiast, avid motorcyclist and gunsmith specializing in historical weapons and restoration. Business experience and interests are in energy and defense technology.
Traduction : MIRASTNEWS
Source : VETERANS TODAY
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